UJI HA CEPAT DAN HA LAMBAT, UJI HI CEPAT DAN HI LAMBAT, SERTA INOKULASI VIRUS PADA TELUR AYAM BEREMBRIO
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Virus adalah suatu unit nonseluler yang minimal mempunyai protein dan asam amino. Virus berbeda dengan mikroorganisme lain karena hanya mengandung salah satu asam nukleat saja, DNA atau RNA. Untuk reproduksinya hanya memerlukan asam nukleat saja. Virus tidak memiliki kemampuan untuk memperbanyak diri di luar sel hidup. Di luar sel hospes, virus terdapat sebagai partikel virus yaitu virion. Virion terdiri dari asam nukleat dan selubung proteinnya yang disebut kapsid. Partikel virus ini disebut nukleocapsid. Nukleokapsid ada yang dalam keadaan telanjang dan ada yang terbungkus oleh suatu membran selubung. Sebagai contoh nukleokapsid yang telanjang dapat ditemukan virus Mosaik tembakau, virus kutil dan Adenovirus. Dan sebagai contoh nukleokapsid yang dibungkus membran sel selubung ialah virus Influenza dan virus Herpes. Virus dapat merusak seluruh kompleks sel dan menimbulkan kerusakan jaringan, bercak-bercak nekrosis dan piringan lisis. Lazimnya hospes virus yaitu tumbuh-tumbuhan, hewan dan mikroorganisme.
1.1 Tujuan
a. Mengetahui prosedur, mekanisme,kegunaan dari HA dan HI test terhadap virus ND
b. Mengetahui ikatan kompleks antara Ab spesifik terhadap antigen
c. Mengetahui cara inokulasi virus pada telur ayam berembrio (TAB)
b. Mengetahui ikatan kompleks antara Ab spesifik terhadap antigen
c. Mengetahui cara inokulasi virus pada telur ayam berembrio (TAB)
BAB II
PERMASALAHAN
2.1 Virus Newcastle Disease (ND)
Virus ND dapat diidentifikasi dengan melihat morfologinya menggunakan mikroskop elektron dan dapat dengan uji serologis. Uji serologis yang dapat dipakai antara lain hemaglutinasi (HA), hambatan hemaglutinasi (HI), netralisasi virus dalam embrio ayam, netralisasi virus dalam kultur sel, MIT test, Egg bit, ELISA, agar gel presipitasi (AGP). Sedangkan antigen virus dapat dilacak dengan tehnik immunohistokimia dan immunofluorescence. Penyakit ini disebabkan virus ND yang tergolong genus Avian Paramyxovirus dan famili Paramyxoviridae yang merupakan virus RNA yang mempunyai genom single strainded (ss) dengan polaritas negatif. Paramyxovirus berbentuk sangat pleomorfik biasanya berbentuk bulat dengan diameter 100-500 nm, tetapi ada juga yang berbentuk filamen. Virus yang tergolong genus paramyxovirus dapat dibedakan dari virus lainnya oleh karena adanya aktifitas neuraminidase yang tidak dimiliki oleh virus lain pada famili Paramyxoviridae. Virus ND mempunyai aktifitas biologik yaitu kemampuan untuk mengaglutinasi dan menghemolisis sel darah merah atau fusi dengan sel-sel tertentu, mempunyai kemampuan neuraminidase dan kemampuan untuk bereplikasi di dalam sel-sel tertentu. Berdasarkan atas kesamaan antigenik pada uji hemaglutinasi inhibisi (HI), maka dikenal 9 serotipe Avian Paramyxovirus, yaitu paramyxovirus tipe 1 (PMV-1) sampai PMV-9. Diantara 9 serotipe tersebut maka virus ND termasuk dalam PMV-1 yang merupakan virus yang terpenting pada unggas. Berdasarkan atas virulensinya, maka virus ND dapat dibedakan menjadi galur velogenik, mesogenik dan lentogenik. Pembagian tersebut berdasarkan atas waktu kematian embrio setelah disuntik oleh virus ND tertentu melalui selaput alantois, waktu kematian embrio untuk galur velogenik adalah kurang dari 60 jam , galur mesogenik sekitar 60-90 jam dan galur limtogenik lebih dari 90 jam . Semua avian Paramyxovirus tumbuh didalam telur ayam bertunas. Berbagai isolat dan strain virus ND berbeda dalam kemampuan dan waktu yang dibutuhkan untuk membunuh telur ayam bertunas. Pada ayam, patogenesitas dari virus ND terutama dipengaruhi oleh galur virus ND, tempat infeksi, umur ayam dan kondisi lingkungan. Virus ND yang terutama bereplikasi di dalam salauran pencernaan akan menyebabkan adanya feses yang tercemar oleh virus tersebut. Penularan virus ND juga dapat terjadi secara oral akibat ingesti feses yang mengandung virus tersebut ataupun secara tidak langsung melalui pakan atau minuman yang tercemar atau perinhalasi akibat menghirup partikel feses yang mengering. Penularan virus ND dapat secara langsung dari ayam yang sakit ke ayam yang peka tergantung pada tempat replikasinya, tetapi dapat juga terjadi secara tidak langsung melalui bahan, alat atau pekerja yang tercemar virus tersebut. Ayam yang menunjukkan gejala gangguan pernafasan akan menyebabkan adanya udara bercampur titik air yang mengandung virus ND yang berasal dari mukus ayam sakit. Penularan virus ND dapat terjadi secara inhalasi. Virus ND dapat ditemukan dalam telur ayam yang terinfeksi virus tersebut tapi penularan secara transovarial mungkin tidak terjadi oleh karena embrio sudah mati sebelum telur menetas. Virus ini juga dapat menembus kerabang telur untuk menginfeksi embrio.
BAB III
PEMBAHASAN
3.1 Hemaglutinasi dan Penghambatan Hemaglutinasi
Virion dari beberapa keluarga virus berikatan dengan sel darah dan menyebabkan hemaglutinasi. Bila antibodi spesifik dan virus dicampur sebelum ditambahi sel darah merah, hemaglutinasi akan dihambat. Uji penghambatan hemaglutinasi ternyata sensitif kecuali untuk togavirus, sangat spesifik, karena uji itu mengukur antibodi yang berikatan pada protein permukaan yang paling gampang mengalami perubahan antigenik. Di samping itu, uji ini untuk mengidentifikasi isolat dari virus yang menyebabkan hemaglutinasi. Beberapa virus mampu mengaglutinasikan eritrosit. Kemampuan ini sebagai contoh dari aktivitas biologik dan aktivitas ini dapat dihambat oleh antibodi tertentu. Sisi partikel virus yang spesifik dapat berinteraksi dengan reseptor mukoprotein pada eritrosit, dan permukaan sel lain. Interaksi dari sisi reseptor dan virion membuat aglutinasi eritrosit menjadi tampak. Enzim virus neuraminidase memecah ikatan antara virus dan sel, dan melepas keduanya ke dalam larutan. Antigen adalah bagian virus yang mengandung ikatan dan antigen dari virus digunakan untuk uji hemaglutinasi. Virus-virus Avian dapat mengaglutinasi eritrosit, termasuk didalamnya NDV (Newcastle Disease Virus), Virus influensa dan virus adenovirus127. Hambatan dari aglutinasi oleh antibodi spesifik merupakan dasar dari uji HA dan HI cepat. Uji HA dan HI cepat merupakan uji yang sesuai dan cepat dilakukan yang penerapannya lebih luas untuk kontrol berbagai penyakit Avian seperti Newcastle Disease maupun Micoplasmosis. Tes HA positif akan menunjukkan adanya suspensi agregat eritrosit yang berkeping-keping. HI cepat menunjukkan positif apabila tidak terlihat aglutinasi pada cairan korioalantois yang diberi antiserum NDV. Uji HA cepat biasanya dipakai untuk mengidentifikasi virus yang mampu menghemaglutinasi eritrosit ayam. Sedang uji HI cepat biasanya dipakai untuk identifikasi NDV.
Uji HA lambat digunakan untuk mengetahui titer virus, kemampuan virus dalam menginfeksi yang ditandai dengan adanya hemaglutinasi eritrosit. Titer virus dapat diketahui dengan melihat sumuran terakhir pada nomor tertinggi (end point) yang menunjukkan adanya hemaglutinasi positif. Hal itu ditandai dengan adanya agregat-agregat di dasar sumur. Prinsip dari uji HI lambat adalah mengetahui adanya antibodi yang mampu menghambat proses hemaglutinasi oleh virus. Uji ini untuk menentukan titik antibodi terhadap hemaglutinasi NDV. Bila terdapat antibodi dalam jumlah mencukupi untuk membentuk kompleks dengan virion, hemaglutinasi dihambat, dan eritrosit mengendap. Sebaliknya bila antibodi terdapat dalam jumlah yang tidak mencukupi maka eritrosit diaglutinasi oleh virus dan membentuk endapan Hemaglutinasi oleh virus ND dapat dihitung dan di bawah kondisi standar dalam cairan dapat di lihat. Reaksi HA dapat di hambat oleh serum immune yang spesifik. Beberapa strain virus ND dapat ditunjukkan virulensinya dalam aktivitas HA dengan eritrosit mamalia dan dalam panas yang stabil
3.2 Inokulasi Virus
Walaupun ditemukan banyak teknik diagnosis secara cepat untuk penyakit virus, isolasi virus masih merupakan standar utama yang harus di pakai bandingan bagi metode yang lebih bagus. Di samping itu, isolasi virus merupakan satu-satunya metode yang dapat mendeteksi, dengan mengidentifikasi virus yang sudah diketahui sebelumnya atau bahkan menemukan agen yang benar-benar baru. Virus dapat di tanam melalui tiga cara yaitu :
1. IN VIVO
Dengan cara ini virus dapat ditanam pada hewan laboratorium yang peka. Metode ini merupakan metode yang pertama kali dalam menanam virus. Metode ini dapat digunakan untuk membedakan virus yang dapat menimbulkan lesi yang hampir mirip misalnya FMDP atau Vesikular Stomatitis pada sapi. Hewan laboratorium yang digunakan antara lain mencit, tikus putih, kelinci ataupun marmut
2. IN OVO
Metode ini merupakan penamaan virus pada telur ayam yang berembrio.
Metode ini dapat dilakukan dengan berbagai cara :
Metode ini dapat dilakukan dengan berbagai cara :
ā Inokulasi pada ruang korioalantois.
Biasanya digunakan embrio ayam dengan umur 10-12 hari. Jarum dimasukkan ¾ inci dengan sudut 45º dan diinjeksikan 0,1-0,2 ml virus yang akan diinokulasikan. Setelah 40-48 jam cairan telur yang sudah diinkubasi dapat di uji untuk hemaglutinasi dengan membuat lubang kecil pada kerabang di pinggir dari rongga udara. Dengan alat semprot yang steril dan jarumnya, diambil 0,1-0,2 ml cairannya. Campur 0,5 cairan telur dengan perbandingan yang sama dari 10% suspensi dari sel darah yang di cuci bersih dalam plate. Putar plate dan lihat aglutinasi setelah 1 menit. Cairan alantois yang terinfeksi di panen setelah 1-4 hari inokulasi dilakukan. Untuk mencegah darah dalam cairan, embrio disimpan semalam dalam suhu 4ºC kemudian injeksi kerabang dekat rongga udara dan buka kerabang tersebut dengan pinset steril. Membran di tekan ke atas yolk sack dan cairan di ambil dengan spuit an dimasukkan ke dalam cawan. Kultur cairan tersebut untuk menghindari cairan terkontaminasi bakteri.
ā Inokulasi pada membran korioalantois
Inokulasi pada embrio umur 10-11 hari adalah yang paling cocok. Telur diletakkan horisontal di atas tempat telur. Disinfektan kerabang disekitar ruang udara dan daerah lain di atas embrio telur. Buat lubang pada daerah tersebut dan diperdalam lagi hingga mencapi membran kerabang. Virus diinokulasikan pada membran korioalantois dan lubang ditutup dengan lilin dan di inkubasi. Setelah 3-6 hari korioalantois membran yang terinfeksi dapat di panen dengan mengeluarkan yolk sack dan embrio secara hati-hati tanpa membuat membran lepas dari kerabang. Area inokulasi dapat di lihat dengan adanya lesi pada CAM sebelum dilepas dari kerabang.
ā Inokulasi pada yolk sack
Inokulasi dilakukan pada embrio umur 5 - 7 hari. Post inokulasi di inkubasi selama 3-10 hari. Virus di inokulasikan pada bagian yolk sack dan dijaga jangan sampai terkontaminasi bakteri.
3. IN VITRO
Inokulasi virus dengan metode ini dilakukan dengan menanam virus pada kultur jaringan. Secara umum kultur jaringan terdiri dari jaringan hidup yang di ambil secara aseptis dari hewan hidup, setelah itu jaringan di campur dengan plasma, serum, Ekstrak jaringan dan suspensi yang dilakukan dalam garam buffer yang kemudian di simpan di dalam tabung atau botol. Virus kemudian diinokulasikan dan diinkubasikan 2-5 hari.
3.3 Perkembangan Virus Dalam Telur Berembrio
Telur ayam berembrio merupakan sistem yang telah lama digunakan secara luas untuk isolasi, perkembangan dan karaterisasi Avian virus serta untuk memproduksi vaksin virus. Embrio dan membran pendukungnya menyediakan keragaman tipe sel yang dibutuhkan untuk kultur berbagai tipe virus yang berbeda. Keberhasilan dalam mengisolasi dan mengembangkan virus tergantung pada beberapa kondisi yaitu: rute inokulasi, umur embrio, temperatur inkubasi, waktu inkubasi setelah inokulasi, volume dan pengenceran dari inokulum yang digunakan,status imun kelompok dimana telur ayam berada. Telur sebaiknya berasal dari kelompok yang bebas dari patogen spesifik ( spesific pathogen free flock ) atau jika tidak mungkin dapat menggunakan telur dari kelompok bebas antibodi NDV. Penggunaan telur dari kelompok antibodi positif akan mengurangi kemampuan virus untuk tumbuh dan berhasilnya isolasi virus. Sejalan dengan banyaknya sistem untuk isolasi virus, dibutuhkan cara untuk mendeteksi infeksi virus. Bukti tidak langsung dari infeksi virus pada embrio ayam dapat diketahui dari satu atau lebih kejadian berikut yaitu : kematian embrio, pembentukan lesi pada CAM seperti edema atau perkembang plak, lesi pada embrio seperti kekerdilan, hemoragi cutaneus, perkembangan otot dan buku yang abnormal, abnormalitas pada organ visceral termasuk pembesaran hepar dan lien, perubahan warna kehijauan pada kaki, focinekrotik pada hepar.
Kemampuan cairan amnionallantois dan untuk menyebabkan hemaglutinasi dari RBC ayam, penggunaan teknik serologis dan molekular, mikroskop elektron. Harus diperhatikan untuk dapat membedakan lesi yang mungkin disebabkan oleh adanya bakteri dan agen lain. Struktur telur embrio langsung dibawah cakang telur terdapat membran kulit telur yang fibrinous. Membran membatasi seluruh permukaan dalam telur dan membentuk rongga udara pada sisi tumpul telur. Membran kulit telur bersama dengan cangkang telur membantu mempertahankan intregitas mikrobiologi dari telur, sementara terjadinya difusi gas kedalam dan keluar telur. Distribusi gas didalam telur dibantu dengan pembentukan CAM yang sangat bervaskuler yang berfungsi sebagai organ respirasi embrio. Pembentukan membran ini terjadi berdekatan dengan membran telur sepanjang telur. Selama pembentukan, membran membentuk ruangan yang relatif besar disebut kantong allantois yang mengandung 5-10 ml cairan allantois. Embrio secara langsung dikelilingi oleh membran amnion yang membentuk kantong amnion yang berisi 1-2 ml cairan amnion. Embrio melekat pada kantoing kuning telur yang berlokasi kira-kira ditengah telur dan menyuplai kebutuhan nutrisi untuk perkembangan embrio. Telur ayam fertil kurang dari satu minggu harus berasal dari kelompok yang sehat, aktif, dan bebas patogen (SPF, spesific patogen free) yang secara teratur diperiksa untuk virus unggas dan bakteri patogen pada umumnya. Telur berembrio yang digunakan dapat berasal dari spesies lain, misalnya : puyuh, bebek, kalkun. Pada induk yang imun, antibodi dapat ditemukan pada kuning telur. Telur dari induk ayam yang positif antibodi dapat digunakan untuk isolasi dan perkembangan bila inokulasi tidak melalui yolk sack. Prosedur isolasi harus selesai sebelum embrio mencapai umur 15 hari inkubasi (waktu dimana antibodi mulai diabsobsi oleh embrio dan bersirkulasi dalam virus). Empat tempat yang paling umum untuk inokulasi pada telur berembrio melalui ruang allantois, yolk sack, CAM, dan kantong amnion.
BAB IV
KESIMPULAN
Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi kondisi pertumbuhan virus adalah tempat inokulasi, umur embrio, temperature inkubasi, lama waktu inkubasi, volume dan pengenceran inokulum yang digunakan, status imun dari induk atau kelompok darimana telur berembrio berasal. Tujuan dari uji HA adalah mengetahui kemampuan virus untuk mengaglutinasi virus. Prinsip HI adalah dengan uji ini diharapkan reaksi aglutinasi dari protein virus dapat dicegah dengan antibodi antigen yang terdapat dalam serum. Inokulasi telur dengan virus ND digunakan untuk mengetahui kultur virus dengan menggunakan telur berembrio. Kultur virus dapat dilakukan dengan cara invivo, invitro dan inovo.
BAB V
DAFTAR PUSTAKA
Fouchier RA, Munster V, Wallensten A, et al. Characterization of a Newcastle Disease Virus eritrosit hemaglutinin . J Virol 2005; 79: 2814-22.
Abstract: http://amedeo.com/lit.php?id=15709000
Meulemans G, Carlier MC, Gonze M, Petit P. Comparison of hemagglutination-inhibition, agar gel precipitin, and enzyme-linked immunosorbent assay for measuring antibodies against NDN viruses in chicken.1987; 31: 560-3.
Abstract:http://amedeo.com/lit.php?id=2960313
FAO. 2006. Wild Bird HPAI Surveillance: Sample collection from healthy, sick and dead birds, by K. Rose, S. Newman, M. Uhart & J. Lubroth. FAO Animal Production and Health Manual, No 4. Rome .
Comments
Post a Comment
Terima kasih sudah berkomentar,semoga bermanfaat